Η ίδρυση του Λ.Ε.Μ.Μ.-Θ. οφείλεται στη Μακεδονική Φιλεκπαιδευτική Αδελφότητα (Κωνσταντινούπολη 1871 - Θεσσαλονίκη 1924 κ.ε.), ένα σωματείο με μεγάλη δράση στον εκπαιδευτικό τομέα.

Το 1931 η Αδελφότητα, με επικεφαλής τον πρόεδρό της, Ιωάννη Τάρη (1885 - 1968), επεκτείνοντας τα ενδιαφέροντά της, ξεκίνησε τη συγκέντρωση λαογραφικού υλικού από το βορειοελλαδικό χώρο. Στις δεκαετίες που ακολούθησαν οι φιλόπονες προσπάθειες των μελών της Αδελφότητας είχαν ως αποτέλεσμα τη συγκέντρωση ενός μεγάλου αριθμού αξιόλογων αντικειμένων, αντιπροσωπευτικών της ζωής των αγροτικών κοινωνιών της Μακεδονίας. Το 1957 ιδρύθηκε ως Νομικό Πρόσωπο Ιδιωτικού Δικαίου το Λαογραφικό Μουσείο Βορείου Ελλάδος που στεγάστηκε σε διαμέρισμα 5 δωματίων στη Λεωφόρο Νίκης 55, στη Θεσσαλονίκη. Το 1958 τον Ιωάννη Τάρη διαδέχθηκε ο Κωνσταντίνος Κεφαλάς (1898 - 1989), ο οποίος συνέχισε με ζήλο το έργο του εμπλουτισμού, της καταγραφής και της έκθεσης της αρχικής συλλογής.

Το 1970, με το νομοθετικό διάταγμα 406/70 και κατόπιν πιέσεων της Αδελφότητας προς τους αρμόδιους κρατικούς φορείς για εξεύρεση μόνιμου και κατάλληλου χώρου που θα στέγαζε τη συλλογή της, σε συνδυασμό με την πεποίθηση για την αναγκαιότητα ύπαρξης λαογραφικού μουσείου στη Βόρεια Ελλάδα, ιδρύεται, ως Νομικό Πρόσωπο Δημοσίου Δικαίου (Ν.Π.Δ.Δ.) με έδρα τη Θεσσαλονίκη, το Λαογραφικό και Εθνολογικό Μουσείο Μακεδονίας (Λ.Ε.Μ.Μ.), στο οποίο παραχωρείται η χρήση του κτηρίου επί της οδού Βασιλίσσης Όλγας 68, που είναι γνωστό ως «Παλαιό Κυβερνείο». Πυρήνα των συλλογών του νέου Μουσείου αποτελεί η συλλογή της Αδελφότητας.

Το 1971 το Μουσείο υπάγεται στην εποπτεία του νεοϊδρυθέντος Υπουργείου Πολιτισμού. Μετά από εργασίες για την προσαρμογή του κτηρίου στις ανάγκες του Μουσείου, το Λ.Ε.Μ.Μ. ανοίγει τις πύλες του στο κοινό  στις 18.2.1973. Το 1980 το Μουσείο, στο πλαίσιο του εκσυγχρονισμού και των νέων μουσειολογικών αντιλήψεων, αναδιοργανώνει τις εκθέσεις του τις οποίες παρουσιάζει στο κοινό  στις 10-4-1981.

Το 1986 η εποπτεία του Μουσείου μεταφέρεται από το Υπουργείο Πολιτισμού στο Υπουργείο Μακεδονίας-Θράκης. Το 1993, με το προεδρικό διάταγμα υπ΄ αριθ. 346, το Μουσείο μετονομάζεται σε Λαογραφικό και Εθνολογικό Μουσείο Μακεδονίας-Θράκης με επέκταση της αρμοδιότητάς του και στη Θράκη. Το 1995 οι εκθέσεις του τίθενται προσωρινά εκτός λειτουργίας για το κοινό, καθώς ξεκινούν στο κτήριο εκτεταμένες εργασίες συντήρησης και ανάπλασης. Το νέο κτήριο παραδίδεται αποκατεστημένο το 2000. Το 2001 η εποπτεία του Λ.Ε.Μ.Μ.-Θ. επανέρχεται στο Υπουργείο Πολιτισμού.

Το 2003, με τη λειτουργία της μόνιμης έκθεσης Στους Μύλους της Μακεδονίας και της Θράκης, το Μουσείο ανοίγει και πάλι τις πόρτες του στο κοινό, εγκαινιάζοντας μια νέα περίοδο ζωής για τον οργανισμό. Το 2005 εγκαινιάζεται η δεύτερη μόνιμη έκθεσή του, που αφορά στις Παραδοσιακές Ενδυμασίες της Μακεδονίας και της Θράκης, 1860-1960.

Σήμερα, το Μουσείο επικοινωνεί με το κοινό με πλήθος δραστηριοτήτων (μόνιμες και περιοδικές εκθέσεις, εκπαιδευτικά προγράμματα, εκδόσεις, ημερίδες, εκδηλώσεις εκπαιδευτικού και ψυχαγωγικού χαρακτήρα). Παράλληλα, εμπλουτίζει τις συλλογές του με δωρεές και αγορές αντικειμένων και αναπτύσσει έντονη δραστηριότητα στον τομέα της ψηφιακής τεκμηρίωσης του πολιτιστικού του αποθέματος.